На 40-м году жизни он овдовел и решил посвятить свою жизнь Богу. Своим местожительством он избрал Золотниковский Успенский монастырь недалеко от Суздаля, где и был пострижен в иночество с именем Митрофан.
Здесь угодник Божий начал иноческое подвижничество, отличаясь глубоким смирением. О его строгой иноческой жизни стало известно в монашеской среде. Через три года после вступления в Золотниковскую обитель братия соседнего Яхромского Космина монастыря, не имевшего в ту пору настоятеля, стали просить местное духовное начальство о поставлении им в игумены Митрофана. Просьба была исполнена. Ведя строгую подвижническую жизнь, Митрофан стал заботливым и снисходительным отцом для монахов, отвечавших ему уважением и послушанием. Этим монастырем он управлял десять лет, его заботами здесь воздвигнут храм в честь Нерукотворного Образа Всемилостивого Спаса.
Когда о ревности подвижника узнал патриарх Московский и всея Руси Иоаким, он возвел его в 1675 году в сан архимандрита и поручил ему более обширную Унженскую обитель, основанную в XV в. преподобным Макарием Желтоводским в Костромской земле. Здесь будущий святитель настоятельствовал около семи лет, в течение которых монастырь достиг процветания. Был построен храм в честь Благовещения Пресвятой Девы Марии с трапезной и колокольней, написано немало замечательных икон.
Монастырь игумена Митрофана привлекал внимание не одного патриарха, но и царя Феодора Алексеевича, который посещал обитель и нередко беседовал с настоятелем. При дворе к святому относились с особым почтением. Когда по решению Московского Церковного Собора 1681–1682 годов была образована новая Воронежская епархия, царь Феодор первым ее епископом предложил назначить игумена Митрофана. Епископскую хиротонию 2 апреля 1682 года возглавил патриарх Иоаким.
Святителю Митрофану пришлось быть свидетелем бунта раскольников в июле того же года и присутствовать на «прении о вере» между старообрядцами и православными в Грановитой палате. Это событие произвело на него сильное впечатление и впоследствии сказалось на его архиерейских делах. Святитель Митрофан приобрел известность как обличитель раскола и сподвижник патриотических начинаний царя-реформатора. Святитель Митрофан рассматривал духовенство как силу, способную воздействовать на население самым благотворным образом.
Особую страницу в биографии святителя Митрофана составляют его взаимоотношения с Петром I. Святитель глубоко и сочувственно входил в судьбу молодого царя, старался содействовать возникавшим полезным для Отечества преобразованиям. Он одобрял постройку флота, предпринятую Петром I в Воронеже, и поддержал ее материально. Когда в 1696 году русские войска одержали победу над турками под Азовом, Петр I повелел святителю Митрофану как бы в награду за участие в этой победе именоваться епископом Воронежским и «Азовским». В то же время святитель Митрофан не мог одобрить слишком тесного общения царя с иноземными иноверцами и бездумного восприятия их обычаев. Святитель отказался посетить воронежский дворец царя из-за находившихся в нем языческих античных статуй. Когда разгневанный Петр стал грозить ему смертью, святитель начал готовиться к ней, предпочитая умереть, нежели одобрить неприемлемые для православного человека языческие ритуалы.
Исповедничество епископа устыдило Петра, в знак согласия с ним он убрал статуи, и мир был восстановлен. На Воронежской кафедре угодник Божий пробыл 20 лет, до самой своей кончины.
С 1820 года число почитателей молитвенной памяти святителя Митрофана особенно возросло, при соборе начали появляться записи о чудесах на его гробнице. В 1831 году последовало официальное донесение об этом Синоду, по решению которого 7 августа 1832 года состоялось торжественное открытие гроба, а затем последовала канонизация святителя. От его святых мощей по милости Божией происходили многочисленные исцеления страждущих телесными и душевными недугами, одержимых, расслабленных. В 1836 году при Благовещенском соборе в Воронеже был учрежден Благовещенский Митрофанов монастырь.